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澳门赌场DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配

发布时间 2020-07-23 13:31

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  DNA 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做 DNA 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体 的配方和步骤,不知和蛋白 PAGE 电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发 一份,十分感谢!一、电泳试剂: 1、30%聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺 29 克,Bis1 克,水 100ml。 2、10%过硫酸胺 过硫酸胺 1 克,水 10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27 克,硼酸 13.75 克,0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml,定容至 500ml。 二、银染试剂 1、固定液:100ml 无水乙醇,5ml 冰醋酸,定容至 1000ml。 2、0.2% AgNO3:AgNO3 1 克,水 500ml。 3、1.5% NaOH:NaOH 7.5 克,水 500ml。 4、37%甲醛。 三、配胶(6%): 30%聚丙烯酰胺(29:1) 8ml,5xTBE 8ml,定容至 40ml,加 10%过硫酸胺 200ul;T EMED 20ul。室温凝固时间1 小时。 四、银染: 1、固定液固定 10m。 2、水洗 2m x3 次。 3、0.2% AgNO3 100ml +37%甲醛 50ul,混匀,避光染色 30~50m。 4、水洗 20 秒 x2 次。 5、1.5% NaOH 100ml,加 37%甲醛 0.5ml,混匀,显色 3~10m。 6、水洗若干次,终止显色。 电泳时间:150v x 3h,溴酚兰的位置相当于 40bp。 银染后胶面积将膨胀 10%。 在终止显色过程中,将依惯性继续显色,所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄,水浸泡过夜将使背景加深转贴!!! 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行 基因组甲基化的筛选,取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度, 背景干扰降到最低,因此在对凝胶进行染色时,往往采用同位素法或银染法,而且 配制的胶往往很大, 我们配制的是大约 40×35cm 的胶, 0.4mm 厚。 同位素十分灵敏, 特异,但是由于其操作的复杂性,许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易 行,便于一般的实验室开展。 需要指出的是,应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法,这样才能保 证灵敏性,我们在长期的工作中积累了一些银染的经验,与大家分享。 下面是网上的一个银染方法,我们使用后觉得效果不错,然后以此为基础,介绍一 下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。 因而至少使用两个盘子, 大小与玻璃板类似。 在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板, 凝胶应该牢固地附着在短玻璃 板上。 2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡 20 分钟或直至样品中染料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。 保留固定/停止溶液,用于终止显影反应。 3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶 3 次,每次 2 分钟。从水中取出, 当转移至下一溶 液时拿着胶板边沿静止 10-20 秒,使水流尽。 4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动 30 分钟。 5. 凝胶显影: (1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μ l)以完成显影液 的配制。 (2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗 5-10 秒。注重,把 凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于 5-10 秒。 浸泡时间过长则导致信号 微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。 (3). 马上将凝胶转移至 1 升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板 带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的 1 升显影液中继续显影 2--3 分钟,或直至所有条带出现。 6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应, 固定凝胶。 7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次 2 分钟, 注重在本操作中戴手套拿着胶板边 缘避免在胶上印上指纹。 8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白,黄色背景 (如纸)上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用 EDF 胶片保留实验结果。 经验分享: (1)固定液:网上有好几种固定液的配制方法,我们采用的是 10%的冰乙酸,用 蒸馏水稀释即可,简便易行。可提前配制,室温放置。 (2) 染色液: 我们用的是 0.1%的硝酸银溶液, 加入 3ml 甲醛。 硝酸银要现用现配, 时间长了硝酸银会分解, 一般在固定的时候配制, 要有一段时间让硝酸银充分溶解。 (3)显影液:用 10%碳酸钠,北化的质量就不错,完全不用买进口的,显影液要 提前配制,放入 4 度冰箱预冷。这一步很重要,假如没有充分预冷,显色时很难控 制显色时间,不是染过了导致背景很高,就是染的很浅。因此在固定前就要把显影 液配好。 (4) 2L 显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μ l)以完成显影液的配 在 制,这一步要在显影前加,不要提前加。原理忘记了,但是一般都是这样做的。 甲醛将银离子还原为金属银,硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则会增 加背景。甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的,根据凝胶染色的效果决定。当时我 是把甲醛调整为 2.7ml,硫代硫酸钠改为 420μ l,两者作用不一样,所以调整的时 候一个多,一个少,而且要微调。具体什么方向调整忘记了,需要摸索最合适的条 件。 (5)也是比较重要的,即一定要分两次显色,第一次显色出现条带后马上转移至剩 下的显影液中。显色时间第一次大概是 5 分钟左右,操作中一定要在边上看着。显 色后马上放入终止液(10%的冰乙酸)中,两分钟后放入纯水中即可,两分中后取 出即可。 (6)对我来说教训最为惨痛的,即显色时间的控制。第二次显色时不要等所有条带 都出来后再终止,因为显色有一个延续效应。当时我染色时,忽然走神了,就走神 5 秒钟,胶全黄了,背景奇高。我两天的工作因为 5 秒钟全部 over 了,当时差点疯 了。 我的经验是:当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止,具体时间需要摸 索,但一定要提前终止。再加一句:万一染色浅了是可以复染的,效果差不太多。 十分感谢!顶下,不错求助:DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 aifuhong 你好,我想请教下:我在做 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,我看到文献中显影液中 有的加硫代硫酸钠,有的文献上没有加,我第一次做这实验不清楚,到底这个加不 加会影响很大吗?aifuhong 你好,我想请教下:我在做 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳,我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠,有的文献上没有加,我第一次做这 实验不清楚,到底这个加不加会影响很大吗?

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