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水晶宫赌场非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PA

发布时间 2020-08-21 07:19

  在一个典型的native PAGE方法中,复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶,蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。

  Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是:考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用,可能导致复合物的分离;并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。

  Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势,其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中,最重要的化合物就是考马斯亮蓝,除了增溶作用以外,蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷,这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是,蛋白质虽然带有大量的负电荷,然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小,蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中,由于带有负电荷,而不会引起蛋白聚合,与酸性染料的结合,膜蛋白也由疏水性变成亲水性,溶解性大大提高。

  Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而,这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用,特别是和质谱联用。

  Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白(PI7)的电泳技术,分辨率通常比BN-PAGE低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此,BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。如测定催化活性(例如线粒体ATP合酶)或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白,CN-PAGE比BN-PAGE更温和,特别是使用洋地黄皂苷时,CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出,但BN-PAGE无法检出。

  CN-PAGE起源于无色非变性PAGE,是BN- PAGE之后出现的技术。既然CN-PAGE中没有带电荷的染料,蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开,特别是PI低于5.4,分辨率低。由此看来,CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和,在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致,但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料,而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。

  QPNC-PAGE(quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis)是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。

  QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲系统(基于Tris-HCl和NaN3)中,一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷,在电场的正负极之间迁移。

  做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?

  我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!

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