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水晶宫赌场聚丙烯酰胺凝胶电泳目的及后续工作

发布时间 2020-08-13 14:08

  聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。其应用可以分为两大类, 一类是属于可以直接在凝胶上观察计算; 另一类需要洗脱回收胶中特定的蛋白和 核酸。 ?蛋白质纯度分析 ?蛋白质分子量测定 直接观察 ?蛋白质定量 ?蛋白质水解分析 ? DNA 测序 洗脱回收蛋白 ?免疫印迹的第一步 ?蛋白质纯化分离 1.蛋白质纯度分析 根据聚丙烯酰胺凝胶条带个数来判断是一种蛋白质还是多种蛋白质的混合 物。 2.蛋白质分子量测定 采用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量。SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然 形状不同对电泳迁移率的影响,SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量 有关, 研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系,因此能够 根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。 以迁移率 Rf 为横坐标,水晶宫赌场,蛋白分子量的常用对数为纵坐标。用已知分子量的 蛋白测出迁移率, 做标准曲线。 从而能根据未知分子量蛋白的迁移率计算出其分 子量。其中 Rf=蛋白迁移距离/示踪染料迁移距离。 3.蛋白质定量 蛋白质混合物中单个蛋白质的定量, 通常是将染色后的凝胶蛋白质条带在分 光光度计上进行扫描,然后对峰面积积分。 4.蛋白质水解分析 蛋白质水解分析常用酶谱法。 明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原 性 SDS-PAGE(含 0.1%明胶)电泳分离,然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复 活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再 脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与酶的量和比活成正比。 5.DNA 测序 目前用于测序的技术主要有 Sanger 等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam 和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸 在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G 四组不同长度 的一系列核苷酸,然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测,从而获得 DNA 序列。 Sanger 法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且 在每个碱基后面进行荧光标记,产生以 A、T、C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸, 然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测,从而获得可见的 DNA 碱基序列。 Sanger 法 测序的原理就是,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)使之扩增,并混入限量 的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3‘-OH 基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止,终止点由反应中相应的双脱 氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几个至千以上 个,相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通 过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影或非 同位素标记进行检测。 6.蛋白质纯化分离 电泳后找切一条泳道进行染色,找到目标蛋白的位置,将未染色的凝胶进行 蛋白质洗脱。洗脱方法有电扩散法和电洗脱法等。电洗脱法步骤:SDS-PAGE 电 泳后,用 250mM KCl 染色 10 分钟(或用考染),蛋白带呈乳白色;手术刀切下 蛋白带,放入透析袋中;将透析袋放常规平板核酸电泳槽,加入与 SDS-PAGE 相同的电泳 buffer; 80V 电泳 2-2.5 小时, 再反向电泳 1-2 分钟; 吸出透析袋中液, 浓缩(可用冻干、丙酮沉淀等);SDS-PAGE 电泳检查电洗脱效果。 7.免疫印迹的第一步 免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋 白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的 抗体检测。 免疫印迹法可非常有效的鉴定某一蛋白质的性质。将蛋白质固定在膜 基质上比直接在凝胶上检测更有优势,因为蛋白质在膜上更容易让试剂接近,膜 比凝胶更容易操作,试剂用量更少,更省时。 免 疫 印 迹 法 分 三 个 阶 段 进 行 . 第 一 阶 段 为 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS-PAGE):抗原等蛋白样品经 SDS 处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中 从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快 .此阶段分离效果肉眼不可见 (只有在染色后才显出电泳区带).第二阶段为电转移:将在凝胶中已经分离的 条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1~2A),通电 45min 转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫 定位:将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次 与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物, 使区带染色.常用的 HRP 底物为 3,3-二氨基联苯胺(呈棕色)和 4-氯-1-萘酚(呈 蓝紫色) .阳性反应的条带清晰可辨, 并可根据 SDS-PAGE 时加入的分子量标准, 确定各组分的分子量.本法综合了 SDS-PAGE 的高分辨力和 ELISA 法的高特异性 和敏感性, 是一个有效的分析手段, 不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性, 并可用于疾病的诊断.在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在 硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒 ,可 方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特 异性抗体。

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