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一种不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法与流程

发布时间 2020-07-30 13:41

  本发明属于生物技术领域,具体是一种应用于分子标记检测的不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

  随着各种分子标记技术的发展和应用,对其进行检测的高分辨率电泳技术的要求也越来越高,目前主要应用的电泳检测方法分为琼脂糖凝胶电泳方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,其中聚丙烯酰胺凝胶电泳方法因为其较高的分辨率得到越来越多的应用。聚丙烯酰胺凝胶电泳主要分为两种形式,一种是非变性胶聚丙烯酰胺凝胶电泳,一种是变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。非变性胶电泳方法相对简单,无需经过样品处理和在凝胶中加入变性剂等过程,操作起来也方便,电泳时间短,通量较高,但是一般情况下检测分辨率低于变性胶。变性胶在样品处理和电泳过程中有一个变性过程,显示的是单条链在胶上的迁移程度,主要体现的是单链构象多态性,这样即使是相同片段长度由于其碱基的不同也可能被检测出来,检测分辨率高,应用更广,但是在样品处理和凝胶制备过程中需要加入去离子甲酰胺或尿素等变性剂,并在电泳过程中维持使其变性的环境,灌胶等操作也相对复杂,通量较低。某些情况下,合适的电泳方法对于分子标记的检测至关重要,例如,在基因图位克隆过程中,需要进行大规模的引物筛选和分子标记检测,特别是在精细定位过程中,标记开发比较困难,有时一两个碱基的差异都必须能开发成可检测的标记。这就需要一种既具备通量高、操作简便又具备较高清晰度和分辨率的电泳检测方法。非变性胶和变性胶在分子标记的检测过程中各有优劣,如果两种方法分别使用,无疑增加了工作量和物力成本。目前尚未见报道有结合非变性胶和变性胶二者优点的电泳检测方法。

  本发明针对非变性胶和变性胶电泳各自存在的优势和不足,提供一种能综合二者优势,通量高、操作简单方便、条带清晰和分辨率高的不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。该方法在一块胶上可以同时体现非变性胶(双链区)和变性胶(单链区)两种指纹图谱。而且在电泳过程中由于部分单链DNA分子的复性形成异源杂合链,可以作为杂合体的指示带,特别是应用在图位克隆分离群体的分子标记检测中,对于重组个体的筛选和鉴定十分有效。

  (1)样品处理,PCR产物与上样缓冲液按比例1∶2混合后,95℃加热5 min,迅速置冰上样或4℃保存;所述上样缓冲液包含98%去离子甲酰胺,10 mM pH8.0 EDTA,0.25% (w/v)溴酚蓝,0.25% (w/v)二甲苯菁;

  (2)凝胶配制,使用6%浓度聚丙烯酰胺溶液,配方是1L溶液含聚丙烯酰胺58g,N,N-亚甲基丙烯酰胺2 g,10×TBE 100 mL,尿素420 g;

  (3)灌胶,使用边条厚度1 mm的玻璃板,用橡皮膏封底,侧边条处用4个夹子夹紧,每70 mL凝胶溶液中加入500 μl AP和70 μl TEMED,立刻混合均匀;装好的玻璃板倾斜30~45度角,将凝胶缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止,注意不要产生气泡,立即插入梳子,室温下放置30 min-1 h聚合;

  (4)上样电泳,待胶凝固后,拔出梳子,使用超纯水或双蒸水冲洗梳孔残留的碎胶,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入1×TBE缓冲液,预电泳10 min,用枪头冲洗梳孔析出的尿素,然后将变性后的PCR产物取1.5 μl加到上样孔中,400-500V,恒压跑2.5-3 h即可(可参考指示剂位置),所述电泳槽具有槽内水循环系统,可以连接自来水进行降温,使电泳温度保持在20℃-25℃室温环境下即可;

  (5)凝胶染色,电泳结束后,取下凝胶,使用银染方法染色,扫描凝胶保存;银染固定液配方为每900 mL去离子水中加入100 mL乙醇和5 mL乙酸;银染液配方为1 L水中加入2 g硝酸银;显影液配方为每800 mL去离子水中,加入24 g NaOH和1mL甲醛,甲醛现用现加。

  所述AP为过硫酸铵催化剂,TEMED为四甲基乙二胺加速剂,TEMED可以加速AP释放游离自由基,催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。

  (4)电泳过程中部分DNA单链分子发生复性,这个过程中也会形成异源杂合DNA双链,可以作为杂合体的指示带;

  (5)使用带槽内水循环系统的电泳槽,连接自来水降温即可,可以连接自来水降温,对电泳温度要求不高,仪器经济实用;灌胶等操作简单,因为使用1 mm厚的玻璃板,用橡皮膏封底,灌胶速度快,不易产生气泡;电泳时间短,在400-500V电压下跑2.5-3h即可;电泳效果条带清晰,分辨率高,甚至可以区分开1-2 bp的片段差异;通量高,如果使用两个电泳槽联用,一人一天(8-10 h)可进行近800个样品的检测。

  本发明在同一块胶里面同时体现非变性胶和变性胶两种指纹图谱,可以结合二者的优点,操作简单,条带清晰,通量高。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,双链DNA分子的迁移主要受分子大小和电荷的影响,这样只有不同长度的DNA分子才能被分开。而单链DNA分子其迁移主要受其单链构象影响,即使相同长度的DNA分子如果其碱基不同也可能被分开。但相对于特定的差异DNA分子的检测,双链和单链形式下获得的分辨率可能各有优势。本发明将两种形式的电泳图谱体现在一张胶上,可以确保获得更高的分辨率。同时因为控制电泳条件使变性后的DNA在电泳过程中发生部分复性,可能导致异源杂合链的产生,从而作为指示带,对于杂合体的筛选和鉴定尤为方便。该方法还可用于其它需要分子标记检测的各个方面,适用于多种基于DNA分子长度差异或碱基差异的分子标记类型,如SSR、STR、ISBP、InDeL、EST、SNP等分子标记。对其它类型分子标记的检测也有借鉴意义。

  使用不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对图位克隆分离群体分子标记的检测。包括如下步骤:

  使用改良CTAB法提取BC3F2群体的基因组DNA,使用Nanodrop微量紫外分光光度计测定其OD值,将DNA浓度稀释到50 ng/μl,4℃放置备用。使用ISBP分子标记引物对分离群体进行PCR扩增后,将PCR产物与loading buffer按1:2的比例混合,使用PCR仪95℃变性5 min,迅速放冰上保存;配置凝胶,使用6%浓度聚丙烯酰胺溶液配方,每升溶液含聚丙烯酰胺58 g,N,N-亚甲基丙烯酰胺2 g,10×TBE 100 mL,尿素420 g;灌胶,使用边条厚度1 mm的玻璃板,用橡皮膏封底,侧边条处用4个夹子夹紧,每70 mL凝胶溶液中加入500 μl AP和70 μl TEMED,立刻混合均匀;装好的玻璃板倾斜30~45度角,将凝胶缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止,注意不要产生气泡,立即插入梳子,室温下放置30 min-1 h聚合;上样电泳,待胶凝固后,拔出梳子,用超纯水冲洗梳孔后,预电泳10 min,然后用1 mL枪头小心吹洗梳孔中析出的尿素,取变性后的PCR产物1.5 μl上样,电泳槽接自来水降温,使电泳温度保持在20℃-25室温,500V恒压电泳3 h。结束后,拆下玻璃板,将凝胶小心从玻璃上剥离,置固定液中固定5 min,超纯水冲洗2次后,使用硝酸银染色5-7 min,染色完毕后使用超纯水迅速冲洗2次,每次不超过20 s,倒入NaOH显色液,直至出现条带(条带显色有个滞后过程,勿显色太过),使用超纯水漂洗两次,扫描保存图像,如图1所示。

  从图1可见,双链区(非变性区)的分离效果明显优于单链区(非变性区),杂合链区作为杂合体的指示,条带清晰,效果明显。

  使用不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对分离群体分子标记的检测,使用高粱BTx623×HN16的F4群体,引物类型InDeL分子标记。其余同实施例1。

  从图2可见,单链区(变性区)的分离效果明显优于双链区(非变性区),杂合链区作为杂合体的指示条带清晰,效果明显。

  使用不完全变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对分离群体分子标记的检测,使用高粱BTx623×HN16的纯合F3家系(aa),引物类型STR分子标记。其余同实施例1。

  从图3可见,双链区(非变性区)和单链区(变性区)对杂合体(重组交换株)的分离效果均不理想,而杂合链区作为杂合体(重组交换株)的指示条带清晰,效果明显。

  下面表1显示实例1-3中不完全变性胶图谱中体现的双链区(非变性区)和单链区(变性区)条带的分离效果。

  由实施例1、2、3和表1可以看出,不同情况下变性胶中单链区、双链区对杂合体和纯合体的分离效果并不一致,这两个区域分别对应DNA分子的变性区和非变性区,因此也体现了变性胶和非变性胶的分离效果。也说明了在某些情况下,变性胶和非变性胶单独使用无法确保较好的分离效果。而使用不完全变性电泳技术,可以使得非变性胶和变性胶的分离效果在一张图谱上得以体现,综合了二者的优点,同时因为电泳过程中杂合体中DNA分子复性形成的异源杂合链DNA,使其电泳速度与单链分子和纯合双链分子均有较大差别,因此可以使其获得很好的区分,这对于杂合体的筛选和鉴定非常有帮助。

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